（一）中药肝复健冲剂对大鼠肝纤维化形成的影响
目的： 观测中药肝复健冲剂对二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝纤维化形成的影响.
方法： 建立DEN诱导大鼠肝硬化模型，同时给予肝复健冲剂进行干预，应用天狼红苦味酸特染法、免疫组化染色法及计算机图像分析技术检测中药对DEN致大鼠肝纤维化过程胶原沉淀及肝细胞增殖特性的影响.
1材料和方法
1.1材料SD雄性大鼠，体质量150~180 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 二乙基亚硝胺(DEN)购自Sigma公司. 天狼红（解放军第475医院赠送）. PCNA检测试剂盒购自DAKO公司. 中药饲料：肝复健冲剂按30.4 g？kg-1均匀混合于基础饲料中压制而成（第四军医大学实验动物中心提供）.
1.2方法
1.2.1模型建立大鼠适应环境3 d随机分为模型组（Model）及中药组(Ganfujian，GFJ)，每组各30只，分别以0.1 g·L-1 DEN自由饮水，同时分别给予基础饲料或含中药的饲料喂养. 16 wk时停用DEN饮水及中药饲料. 考虑到造模过程大鼠有一定死亡率，分别于建模开始后每4 wk两组各处死5只大鼠，剩余大鼠留继续观察. 取肝组织固定于100 g·L-1甲醛溶液，石蜡包埋，切片厚4 μm. 常规HE染色、切片胶原特殊染色及免疫组化染色.
1.2.2切片胶原染色按天狼红饱和苦味酸法［4］. 普通石蜡切片，厚4 μm；常规脱蜡至水，0.1 mol？L-1天狼红饱和苦味酸，避光室温孵育20 min；不洗，950 mL？L-1乙醇脱水，二甲苯透明，封片.
1.2.3PCNA免疫组织化学染色取材肝组织固定于100 mL？L-1缓冲甲醛溶液24 h，常规石蜡包埋，切4 μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；染色方法为免疫ABC法. 以0.1 mol？L-1 PBS 取代一抗作阴性对照，以正常大鼠肝组织作正常对照.
1.2.4染色结果判定及计算机图像分析肝脏背景为淡黄色，胶原阳性着色呈红色， 采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统，随机选择5个汇管区进行染色胶原的定量分析(面积占视野面积)，取其均值. PCNA阳性着色为覆盖胞核的棕黄色颗粒. 用网格（10×10）测试法计数阳性肝细胞. 切片各选择10个按同一方向移行、不重叠的高倍镜视野（×40），记数阳性及阴性细胞数（100个细胞）.
统计学处理：采用SPSS统计分析软件对所获得的数据进行组间秩和检验.
2结果
2.1大鼠肝纤维化过程组织形态学变化模型组大鼠使用DEN 4~8 wk时肝表面由平滑逐渐变为粗糙，可见小颗粒，呈局灶性. 光镜下肝细胞肿胀，空泡变性，局灶性坏死，伴炎细胞浸润，并逐渐出现纤维组织增生. 12 wk时40%大鼠已出现明显肝硬化，肝表面更加粗糙，肝脏增大、肿胀，色暗或淡. 16 wk时大鼠均有肝硬化表现，结节增多变大，肝脏缩小，组织学有大量形态不一，大小排列不齐的假小叶形成. 部分大鼠肝脏已出现早期癌结节，镜下可见少量癌细胞增生. 中药组大鼠各时期肝脏损害均较单纯诱导组轻，12 wk无肝硬化大鼠，16 wk 50%大鼠出现肝硬化，但未发现癌变.
2.2大鼠肝纤维化过程肝内胶原沉积变化模型组大鼠4 wk肝内即出现少量红色胶原阳性染色，多集中于汇管区. 随着肝内病变加重，假小叶的形成，肝脏沉积的胶原逐渐增多， 16 wk病变以结节性肝硬化为主，切片胶原沉积量亦达到顶峰. 中药组大鼠肝内病变较模型组明显减轻，肝硬化发生晚，肝内胶原沉积量少，在4 wk及12 wk两组间差异有统计学意义(P<；0.05， Tab 1).
2.3大鼠肝纤维化过程肝细胞阳性表达PCNA情况在模型初期即可见少量肝细胞PCNA阳性着色，随着模型进展，大鼠肝脏PCNA阳性表达的肝细胞数目逐渐增加，并在12～16 wk呈明显攀升趋势. 中药组大鼠PCNA阳性的肝细胞数在各期均低于模型组，其中12～16 wk差异显著(P<；0.05， Tab 2).
3讨论
肝纤维化是许多慢性肝病重要的中间环节，是由于肝内纤维生成与降解失衡，致使过多的胶原在肝内沉积，常伴于炎症并可发展为肝硬化. 肝纤维化形成作为肝硬化发展过程中的一个重要现象，与肝硬变的发展是平行的［5］，因此肝纤维化程度的精确了解是慢性肝病研究不可少的. 然而常用的血清学指标和组织学纤维化分级标准却难以直接、准确反映肝脏内胶原沉积变化. 本文采用切片胶原图像定量处理方法具有准确、客观、数据可信度高等特点，能精确反映肝内胶原沉积（主要为I， III型胶原）变化［4］. 本实验中应用该法检测DEN诱导大鼠肝纤维化过程中肝内胶原沉积的变化，结果显示随着肝细胞变性、炎症高峰到桥接性坏死、肝硬化形成，肝脏形态学改变与胶原沉积呈同步变化.
细胞的异常增殖是癌变发生的主要特征. PCNA是一种从细胞核中分离纯化出来的多肽链，直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其含量和阳性表达是反应G1晚期和S早期肝细胞增殖的常用指标［6-8］. 在本模型中初期即出现少量肝细胞PCNA阳性着色，而随着模型进展，尤其在12~16 wk（肝硬化期）PCNA阳性肝细胞数明显增加，与肝内病变进展呈一致变化. 即随着肝硬化的形成，异常增殖肝细胞数目呈明显增加趋势，提示从肝脏炎性改变、肝纤维化至肝硬化的形成，异常增殖的肝细胞数目不断增加，癌变的可能性亦逐渐增加.
近年来中医药防治肝纤维化取得了不少进展，也积累了丰富的经验，从单味药、复方及其有效成份等入手，初步发现活血化瘀与扶正补虚两类中药具有良好的防治肝纤维化作用. 由于采用中草药治疗慢性肝病在临床上有肯定疗效，且又具有无明显毒性反应或副作用的优点，因此，是防治肝纤维化较有希望的治疗手段，已引起国内外肝病研究人员的极大兴趣［9］. 健脾扶正法是防治肝硬化与肝癌最常用的方法之一，曾证明对肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病变的发生可能有一定的预防作用［10-12］. 肝复健冲剂以健脾益气立法，组方均为药食同源中药，具有低毒、可长期服用的特点. 本实验结果显示该冲剂可明显减少肝内胶原沉积，延缓化学致癌物DEN所致大鼠肝纤维化过程，同时对肝硬化形成期阳性表达PCNA的肝细胞数目亦有显著抑制作用. 提示该冲剂可通过减轻化学物质引起的肝内炎性病变，减少肝内以I、III型为主的胶原沉积，延缓和减轻肝纤维化过程，同时可抑制肝硬化形成及演变期肝细胞可能的恶性增殖，达到阻抑肝硬化形成及其继续发展为肝癌的作用.
（二）大蒜素对实验性大鼠肝纤维化的作用研究
大蒜素是强效抗氧化剂，目前国内外研究显示它能增强肝脏谷胱甘肽抗氧化系统功能，能拮抗乙醇氧化性肝损伤。本研究通过对肝脏病理学、超微结构、细胞外基质与肝纤维化相关指标的观测研究大蒜素对肝纤维化的防治作用。
一、材料和方法
1、材料：SD大鼠46只，雌雄兼用，体重220-260g，由苏州大学实验动物中心提供。大蒜素微粒：江苏省靖江制药厂提供，批号：2001011.2。秋水仙碱：昆明制药有限公司，批号：980732，规格：0.5mg／片。二甲基亚硝胺(DMN)：上海开明化学厂生产化学纯，批号：0161072。酶联免疫检测试剂盒等均由上海森雄科技实业有限公司提供。
2、仪器：①透视电子显微镜CH600，日本Hitachi。②酶标仪：Denley Dragon Wellscan MKI芬兰Lab systems提供。
3、方法①动物分组：正常对照组(n=6)：予蒸馏水灌胃，生理盐水腹腔注射；模型组(n=8)：蒸馏水，DMN；小剂量大蒜素预防组(n=8)：予大蒜素11mg·kg-1·d-1，DMN；中剂量大蒜素预防组(n=8)：予大蒜素22mg·kg-1·d-1，DMN；中剂量大蒜素治疗组(n=8)：予大蒜素22mg·kg-1．d-1，DMN；秋水仙碱组(n=8)：予秋水仙碱0.15mg·kg-1．d-1，DMN。给药方法：用生理盐水将DMN配成0．5％的溶液10mg·kg-1·次-l腹腔注射，第1周每天1次，连续3d，第2～4周每周1次，第5、6周均每天1次，连续2d，实验结束后腹主动脉取血制备血清。采血后取肝脏左叶常规固定备用。将大蒜素用蒸馏水分别配成相应浓度，按10m1·kg-1．次-1灌胃给药。除大蒜素中剂量治疗组在模型建立3周后给药，余各组在建模开始时同时给药。②观测指标及方法：检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白，I型前胶原肽(PINP)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)和透明质酸(HA)检测采用双抗体夹心ABC-ELISA法。层粘连蛋白(LN)检测采用酶联免疫竞争法。肝组织HE染色及胶原纤维(V-G)、网状纤维特殊染色(Gommori)。
二、结果
1、大蒜素对大鼠肝纤维化模型肝功能影响：模型组血清AST和ALT活性明显增加，分别为正常对照组的1.7倍(p<；0.01)和1.5倍(p<；0.01)。大蒜素抑制DMN所致的上述改变，可使血清AST和ALT活性完全恢复正常，并能提高血清白蛋白含量，而秋水仙碱则无降低AST、ALT及升高血清白蛋白含量作用(p>；0.05)。
2、大蒜素对大鼠血清纤维化指标的影响：模型组LN、HA、P工NP、PⅢNP较正常组明显增加(p<；0.05)，大蒜素小、中剂量预防组、中剂量治疗组LN、PINP、PⅢNP较模型组明显下降(p<；0.05)，其中大蒜素中剂量预防组对降低HA、LN、PINP、PⅢNP作用最大。秋水仙碱组仅对LN、PⅢNP减少作用显著。
3、大蒜素对肝组织病理学影响：HE染色、Gommori、V-G染色均显示大蒜素预防和治疗组与模型组相比，可明显减轻纤维化等级及SSS分值。
4、光镜结果：正常组：肝小叶内网状纤维支架完整，分布规则，无胶原纤维存在。模型组：肝细胞变性坏死，肝小叶结构破坏，纤维组织增生，假小叶形成。大蒜素组：中央静脉周围可见纤维组织，未见明显假小叶形成。
5、电镜结果：模型组肝细胞萎缩，线粒体固缩或肿胀，细胞内见大量脂滴及空泡样变，小胆管扩张，胆管上皮增生，微绒毛减少。Disse间隙见多处纤维沉积，肝窦内皮细胞的窗孔消失，内皮细胞下基底膜形成。大蒜素组Disse间隙纤维化明显减轻，其中中剂量大蒜素组接近正常。
讨论
目前研究发现大蒜素对四氯化碳诱发大鼠肝损伤引起的AST和脂质过氧化产物丙二醛水平的升高有明显的抑制作用，这种作用具有剂量效应关系。
血清LN、HA、PINP、PⅢNP是检测肝纤维化可靠的血清学指标。其中LN、PⅢNP在肝纤维化过程早期出现，常与肝细胞的炎症坏死有关，尤其是LN参与形成肝窦内皮细胞基底膜。而HA、PINP在肝纤维化过程晚期出现，可作为衡量药物抗肝纤维化效应指标。本组结果示大蒜素各组PINP、PⅢNP、LN均低于模型组，表明其肝内合成纤维受到抑制，肝组织学显示大蒜素可降低肝纤维化等级及SSS分值。其中以中剂量预防组效果最好，电镜观察同样显示大蒜素各防治组Disse间隙及肝窦纤维沉积及抑制内皮细胞基底膜形成较模型组明显好转。提示大蒜素对实验性肝纤维化具有一定的预防和治疗作用。
大蒜素抗实验性肝纤维化的可能机制为：①大蒜素具有良好的抗氧化作用。肝细胞损伤可产生脂质过氧化产物如丙二醛等激活肝星状细胞(HSC)合成胶原。抗氧化治疗有利于减轻肝损伤和肝纤维化。本实验在DMN造模大鼠中观察到肝功能改善，提示大蒜素可通过抑制脂质过氧化而对肝损伤及纤维化起抑制作用。②间接抑制HSC细胞转化。HSC在肝受损时被激活，转化成肌成纤维细胞(MFBLC)。
目前研究认为，大蒜素由于其抗脂质过氧化(LPO)作用使血管内前列腺素(PG)I：明显增加，PGI：能抑制血小板衍生生长因子(PDGF)激活的DNA合成而抑制血管平滑肌细胞增殖。大蒜素可能通过抑制PDGF激活的DNA合成而抑制HSC的增殖。③大蒜素还能提高纤维蛋白自溶解活性，从而使纤维蛋白降解产物(FDP)增加。本组设立治疗组，在肝纤维化造模3周后给药，结果表明大蒜素治疗组肝脏病理组织学检查及胶原蛋白含量与肝纤维化模型组差异有显著性，说明大蒜素可能具有促进胶原蛋白降解与胶原纤维重吸收的作用。
阴阳平衡
