检查

1.病原学检查由于真菌广泛分布于自然界，甚至空气中也常有孢子飞扬，采集粪标本和检查操作中，应尽可能减少污染，标本要新鲜。有些真菌传染性很强如荚膜组织胞浆菌，应注意安全防护，以免造成实验室人员感染。

(1)直接镜检标本：以10%氢氧化钾或生理盐水制片，高倍镜下发现大量菌丝和孢子有诊断意义。对于双相型真菌，仅查到孢子可能是正常带菌。真菌性肠炎的6种常见病原多数情况下直接镜检即可鉴定，但孢子、菌丝和其他背景物质有时相互混淆，不易辨认。

①菌丝和孢子：菌丝粗细一致，除毛霉菌外均有分隔，可见不同角度的分支，细胞质均匀，内含大小不等的颗粒。孢子多为圆形或卵圆形，多数大小一致，边缘整齐，可见细胞构造。

②细胞壁：在氢氧化钾溶液处理的标本中，细胞壁常变宽，连接成弧状，类似菌丝，但无菌丝的构造。

③石棉体：比菌丝更细，不分节，无菌丝颗粒。

④植物纤维：未消化的食物残渣，边缘不整，无分支。

⑤脂细胞：圆形，构造模糊，无细胞壁。

⑥磷脂小球：大小不一，形状不整，无细胞构造。

⑦氢氧化钾结晶：雪花样或珊瑚状，边缘呈锯齿形，折光性强。

⑧小水疱：圆形，透亮，无细胞构造。

(2)染色镜检常用的染色方法：

①革兰染色：适用于念珠菌，孢子、菌丝染成蓝色，但着色不均。

②过碘酸锡夫染色(PA5)：真菌孢子、菌丝均染成红色。

③丫啶橙染色：荧光显微镜下真菌孢子呈亮绿色。

④吉姆萨染色和瑞特染色：适用于荚膜组织胞浆菌，染色前用甲醇固定，油镜下菌体染成红色，较小一端有出芽，菌体周围有一圈荚膜样结构，为此菌的细胞壁。通常菌体位于巨噬细胞或单核细胞内，少数位于细胞外。

⑤乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌培养涂片，菌体染成蓝色。

(3)真菌培养：粪标本直接镜检通常不容易确定菌种，需参考粪培养结果，观察菌落形态，再挑取菌落染色后镜检。常用沙保培养基和血琼脂培养基。对于双相型真菌还需在不同温度下(25℃或37℃)分别培养，以便观察其形态改变。

①大培养：是鉴别真菌的主要方法之一，可观察菌落的生长情况。根据菌落的生长速度、形态、色泽等，初步判别菌种。

A.试管斜面：用白金环刺破琼脂平面，分3点将标本接种于试管斜面培养基上。此法不易污染，但菌落较小。

B.培养皿：分3点将标本接种于平皿培养基中央，倒置后放恒温箱中培养，每3天观察1次菌落生长情况。

②小培养：将大培养中生长较好的菌落接种在玻片培养基上。培养1～3天后，在显微镜下观察菌体的特征。

A.点片法：先将少许培养基成形于载玻片中央，再将菌种接种于培养基边缘。覆以盖玻片，置于有U形管的玻璃平皿中，培养后于不同时间取出镜下观察或染色镜检。

B.压片法：将菌种接种在试管斜面或平皿培养基上，覆一盖玻片，以便菌体向盖玻片上生长，然后于适当时间取出置于载玻片上镜检。