1、PCR检测核酸扩增技术的应用,尤其是广谱PCR技术和基因测序已经成功用于检测和确诊巴尔通体感染。为评估PCR方法的检测效能,SophieW等用特异性引物对46名临床确诊的CSD病人进行htrA基因的PCR扩增,结果45份扩增出414bp的阳性片断,灵敏度高达98%,特异度100%(41/41)。而Hansmann用同样的引物对临床CSD病人的淋巴标本进行PCR检测,灵敏度仅76%。通过对汉赛巴尔通体16SrRNA编码基因进行分析,可区分出2种不同的基因型即Houston-1和Marseille型,同时也代表了人类分离株的2种不同的血清型(HoustonⅠ;MarseilleⅡ型)。另外,柠檬酸合成酶基因(gltA)、16S核糖体DNA(rDNA)、DNA指纹印迹分析如重复序列聚合酶联反应(REP-PCR)和肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)等也可用于区分汉塞巴尔通体的2种基因型。Hsp60基因groEL和rpoB的序列变异可在种水平上区分出汉塞巴尔通体及其2种不同的基因型。Zeaiter等分别用起源于基因间隔区(ITS)、groEL及pap31序列的3对特异性引物对临床确诊的CSD病人的淋巴活检标本进行PCR检测,扩增出3种特异性基因片断,证明ITS引物种属水平上检测巴尔通体,groEL引物则可区分出2种不同的汉赛巴尔通体即Houston-1和Marseille型,而pap31引物则能更详细的区分出4种不同汉赛巴尔通体亚型即Marseille、CAL-1、Houston-1和1种新的变异性ZF-1。但PCR方法尚存在很大缺陷,如PCR引物结合缺乏特异性,实验室污染等。
2、血清学方法分离巴尔通体通常既耗时又不易成功,PCR在检测临床样品时可作为一种快速特异的病原检测方法,但需要适当的实验设备和器材。对于许多临床实验室来说,确诊临床可疑CSD最实用的诊断方法是血清学检测。
(1)免疫荧光抗体检测(IFA)汉赛巴尔通体作为CSD的主要致病菌,主要是依靠IFA的血清学方法进行检测。汉赛巴尔通体易于自动黏附,这种细菌成簇的现象会阻碍产生分散的全菌抗原,血清学检测的灵敏度因不同实验室而异,从100%到30%以下不等,在预测IFA诊断效能的早期报道中,用汉赛巴尔通体IgG≥1∶64的滴度检测CSD,灵敏度为84%(38/45),特异度为96%(108/112)。另一项研究表明,对于临床诊断的CSD病例,88%的汉赛巴尔通体IgG≥1∶64,而世界各地的健康人群调查,汉赛巴尔通体抗体阳性率在36%~11%不等。2003年Rolain等用PCR确诊的200名CSD病人血清进行IFA方法的评估,结果发现,其灵敏度86.8%,特异度74.1%,阳性预测值 79.6% 。Michael等用商业化的巴尔通体IgG抗原片(MRL)检测城市和农村人群猫抓病血清标本,灵敏度和特异度分别为84.6%和93.4%。Bergmans等认为,用IFA方法进行检测时,汉赛巴尔通体与Vero细胞混合培养几天要比混合培养几小时的灵敏度要高。IFA主要用来检测抗BhenselaeIgG抗体,对抗IgM的检测不理想。另外,来自观察者的变异也影响结果的判断,IFA也不适合自动化操作和大规模样本检测。另外,当用细菌全细胞作为抗原时,则存在特异性抗原的血清学交叉反应,尤其是与五日热巴尔通体之间的交叉反应。
(2)酶免疫学实验(EIA) 目前,用于巴尔通体酶免疫试验多是用灭活的细菌全抗原和提取的外膜蛋白抗原。常规的外膜蛋白的制备方法是将巴尔通体菌株接种在含5%的血琼脂培养基上,在37℃,5%CO2环境中培养1周左右,收集菌落用缓冲液悬浮、洗涤并离心,56℃30min灭活后,用超声波粉碎机粉碎并离心除去较大的细胞碎片和细胞器等,对上清液进行约100000g超速离心1h,取沉淀悬浮于缓冲液中,离心重复3次。最后,取沉淀悬浮于蒸馏水中即可。用外膜蛋白包被高吸附ELISA板,进行酶联免疫抗体的测定是国外实验室较常用的方法。Patnaik等用EIA方法检测确诊的CSD病人,其中94%的血清抗汉赛巴尔通体IgG阳性,10%的对照阳性,仅2%的健康献血者中抗汉赛巴尔通体IgG阳性。
(3)血清学检测影响因素几个因素可能会影响血清学检测的灵敏度。首先,灵敏度根据疾病的定义不同而改变。CSD曾被定义为局限性淋巴管炎伴特征性组织病理学变化(肉芽肿),有猫接触史和猫抓的皮肤损伤点,皮肤抗 原检测阳性,并排出其他原因造成的淋巴管炎。近年来,这些限制性的诊断方法已很少使用,皮肤的抗原检测由于其潜在的健康隐患已逐渐被淘汰,淋巴活检也很少使用。然而,很多抗汉赛巴尔通体抗体水平较高的病人却没有明显的猫接触史,许多病人也没有明显的CSD特征,用上述限制性的定义可能会高估血清学检测的灵敏度。另外,临界值的高低也可影响到血清学灵敏度,Zangwill等报道的灵敏度和特异度分别为84%和90%,若临界值定在1∶512,特异度可高达99%,而灵敏度则下降到64%。巴尔通体菌株在血琼脂培养上进行传代培养,即使是有限的几代,与从猫血中新鲜分离的菌株相比,也能导致菌株毒力的减弱,从而产生较低的抗体反应。另外,抗原的制备对结果的影响也很大,同细胞培养菌株相比,用琼脂培养基培养的菌株制备的抗原其A值偏低。另外,抗原变异也可导致较弱的抗原抗体反应。血清学方法尤其是IFA,已经是临床及实验室诊断猫抓病最广泛和实用的方法,但血清学方法不能区分出汉赛和五日热巴尔通体的感染。Sander等报道的猫抓病人中,两者之间的交叉反应高达95%以上。汉赛巴尔通体与Coxiellaburnetii和Chlamydiapsittaci之间也存在较强的交叉反应。在进行免疫学检测之前,对可能造成交叉反应的抗原进行血清吸收试验,可提高检测效果。另外,用当地的分离株或混合株作为抗原用EIA和IFA检测可提高血清学诊断CSD的效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹分析(westernblotting)也是实验室常用的诊断猫抓病的辅助方法,通过不同的SDS-PAGE蛋白电泳图分析,可区分出不同巴尔通体种属,用无日热巴尔通体、汉赛巴尔通体、杆菌性巴尔通体(Bbacilliformis)及伊丽莎白巴尔通体(Belizabethae)的抗血清做Westernblotting实验,也能区分出不同的巴尔通体种属和亚种。一些实验室也用斑点杂交试验和细胞脂肪酸分析进行猫抓病及巴尔通体感染的辅助检测。