观测中药肝复健冲剂对二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝纤维化形成的 影响.
建立DEN诱导大鼠肝硬化 模型，同时给予肝复健冲剂进行干预，应用天狼红苦味酸特染法、免疫组化染色法及计算机图像分析技术检测中药对DEN致大鼠肝纤维化过程胶原沉淀及肝细胞增殖特性的影响.
1材料和方法
1.1材料SD雄性大鼠，体质量150~180 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 二乙基亚硝胺(DEN)购自Sigma公司. 天狼红（由解放军第475医院赠送）. PCNA检测试剂盒购自DAKO公司. 中药饲料：肝复健冲剂按30.4 g？kg-1均匀混合于基础饲料中压制而成（第四军医大学实验动物中心提供）.
1.2方法
1.2.1模型建立大鼠适应环境3 d随机分为模型组（Model）及中药组(Ganfujian，GFJ)，每组各30只，分别以0.1 g·L-1 DEN自由饮水，同时分别给予基础饲料或含中药的饲料喂养. 16 wk时停用DEN饮水及中药饲料. 考虑到造模过程大鼠有一定死亡率，分别于建模开始后每4 wk两组各处死5只大鼠，剩余大鼠留继续观察. 取肝组织固定于100 g·L-1甲醛溶液，石蜡包埋，切片厚4 μm. 常规HE染色、切片胶原特殊染色及免疫组化 染色.
1.2.2切片胶原染色按天狼红饱和苦味酸法[4]. 普通石蜡切片，厚4 μm；常规脱蜡至水，0.1 mol？L-1天狼红饱和苦味酸，避光室温孵育20 min；不洗，950 mL？L-1乙醇脱水，二甲苯透明，封片.
1.2.3PCNA免疫组织化学染色取材肝组织固定于100 mL？L-1缓冲甲醛溶液24 h，常规石蜡包埋，切4 μm厚切片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水；染色方法为 免疫ABC法. 以0.1 mol？L-1 PBS 取代一抗作阴性对照，以正常大鼠肝组织作正常对照.
1.2.4染色结果判定及计算机图像分析肝脏背景为淡黄色，胶原阳性着色呈红色， 采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统，随机选择5个汇管区进行染色胶原的定量分析(面积占视野面积)，取其均值. PCNA阳性着色为覆盖胞核的棕黄色颗粒. 用网格（10×10）测试法计数阳性肝细胞. 切片各选择10个按同一方向移行、不重叠的高倍镜视野（×40），记数阳性及阴性细胞数（100个细胞）.
采用SPSS统计分析软件对所获得的数据进行组间秩和检验.
2.1大鼠肝纤维化过程组织形态学变化模型组大鼠使用DEN 4~8 wk时肝表面由平滑逐渐变为粗糙，可见小颗粒，呈局灶性. 光镜下肝细胞肿胀，空泡变性，局灶性坏死，伴炎细胞浸润，并逐渐出现纤维组织增生. 12 wk时40%大鼠已出现明显肝硬化，肝表面更加粗糙，肝脏增大、肿胀，色暗或淡. 16 wk时大鼠均有肝硬化表现，结节增多变大，肝脏缩小，组织学有大量形态不一，大小排列不齐的假小叶形成. 部分大鼠肝脏已出现早期癌结节，镜下可见少量癌细胞增生. 中药组大鼠各时期肝脏损害均较单纯诱导组轻，12 wk无肝硬化大鼠，16 wk 50%大鼠出现肝硬化，但未发现癌变.
2.2大鼠肝纤维化过程肝内胶原沉积变化模型组大鼠4 wk肝内即出现少量红色胶原阳性染色，多集中于汇管区. 随着肝内病变加重，假小叶的形成，肝脏沉积的胶原逐渐增多， 16 wk病变以结节性肝硬化为主，切片胶原沉积量亦达到顶峰. 中药组大鼠肝内病变较模型组明显减轻，肝硬化发生晚，肝内胶原沉积量少，在4 wk及12 wk两组间差异有统计学意义(P<；0.05， Tab 1).
2.3大鼠肝纤维化过程肝细胞阳性表达PCNA情况在模型初期即可见少量肝细胞PCNA阳性着色，随着模型进展，大鼠肝脏PCNA阳性表达的肝细胞数目逐渐增加，并在12～16 wk呈明显攀升趋势. 中药组大鼠PCNA阳性的肝细胞数在各期均低于模型组，其中12～16 wk差异显著(P<；0.05， Tab 2).
肝纤维化是许多 慢性肝病重要的中间环节，是由于肝内纤维生成与降解失衡，致使过多的胶原在肝内沉积，常伴于炎症并可发展为肝硬化. 肝纤维化形成作为肝硬化发展过程中的一个重要现象，与肝硬变的发展是平行的[5]，因此肝纤维化程度的精确了解是慢性肝病研究不可少的. 然而常用的血清学指标和组织学纤维化分级标准却难以直接、准确反映肝脏内胶原沉积变化. 本文采用切片胶原图像定量处理方法具有准确、客观、数据可信度高等特点，能精确反映肝内胶原沉积（主要为I， III型胶原）变化[4]. 本实验中应用该法检测DEN诱导大鼠肝纤维化过程中肝内胶原沉积的变化，结果显示随着肝细胞变性、炎症高峰到桥接性坏死、肝硬化形成，肝脏形态学改变与胶原沉积呈同步变化.
细胞的异常增殖是癌变发生的主要特征. PCNA是一种从细胞核中分离纯化出来的多肽链，直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其含量和阳性表达是反应G1晚期和S早期肝细胞增殖的常用指标[6-8]. 在本模型中初期即出现少量肝细胞PCNA阳性着色，而随着模型进展，尤其在12~16 wk（肝硬化期）PCNA阳性肝细胞数明显增加，与肝内病变进展呈一致变化. 即随着肝硬化的形成，异常增殖肝细胞数目呈明显增加趋势，提示从肝脏炎性改变、肝纤维化至肝硬化的形成，异常增殖的肝细胞数目不断增加，癌变的可能性亦逐渐增加.
中医药防治肝纤维化取得了不少进展，也积累了丰富的经验，从单味药、复方及其有效成份等入手，初步发现活血化瘀与扶正补虚两类中药具有良好的防治肝纤维化作用. 由于采用中草药治疗慢性肝病在临床上有肯定疗效，且又具有无明显毒性反应或副作用的优点，因此，是防治肝纤维化较有希望的治疗手段，已引起国内外肝病研究人员的极大兴趣[9]. 健脾扶正法是防治肝硬化与肝癌最常用的方法之一，曾证明对肝硬化和DEN致大鼠肝癌前病变的发生可能有一定的预防作用[10-12]. 肝复健冲剂以健脾益气立法，组方均为药食同源中药，具有低毒、可长期服用的特点. 本实验结果显示该冲剂可明显减少肝内胶原沉积，延缓化学致癌物DEN所致大鼠肝纤维化过程，同时对肝硬化形成期阳性表达PCNA的肝细胞数目亦有显著抑制作用. 提示该冲剂可通过减轻化学物质引起的肝内炎性病变，减少肝内以I、III型为主的胶原沉积，延缓和减轻肝纤维化过程，同时可抑制肝硬化形成及演变期肝细胞可能的恶性增殖，达到阻抑肝硬化形成及其继续发展为肝癌的作用.
阴阳平衡