本病确诊有赖于大便中发现等孢球虫卵囊,取新鲜大便并经硫酸锌漂浮浓集后镜检可以提高卵囊检出率,等孢子球虫卵囊透明度较高,在直接涂片中很容易遗漏,此时可将显微镜光圈缩小直至涂片中其他原虫或细菌轮廓清晰,有助鉴别,鉴别时主要依据为卵囊大小,子孢子数目,子孢子周围是否存在孢子囊等,除大便检查以外,小肠黏膜活检和肠内容物检查,也可能发现等孢子球虫发育的各期形态,十二指肠引流液检查,部分患者亦可获阳性结果。
本病应注意与其他腹泻相鉴别,等孢子球虫病广泛分布于热带和亚热带,尤应与阿米巴痢疾,肠滴虫病,蓝氏贾第鞭毛虫病,隐孢子虫病等区别,惟本病人体感染相当少见。